Die Uffizien beherbergen eine der bedeutendsten Gemäldegalerien der Welt. Die Sammlung mit ihren mehr als 1500 Exponaten umfasst neben weltberühmten Gemälden die grafische Sammlung -Gabinetto dei Disegni e delle Stampe-, deren Bestand weit über 100 000 Blätter, darunter hervorragende Zeichnungen Florentiner Renaissancemeister, umfasst.

Die Medici ergänzten die Sammlung mit Werken der Malerei und Bildhauerei bis 1737, als die Privatgalerie von der letzten Erbin des Hauses, der Kurfürstin Anna Maria Ludovica von der Pfalz, der Stadt Florenz hinterlassen wurde. Im 18. Jahrhunderten hatte die Sammlung der Uffizien auch über Florenz hinaus bereits Berühmtheit erlangt.

In der zweiten Etage befindet sich die von Leopoldo de Medici im 17. Jahrhundert begründete Sammlung von Zeichnungen und Drucken.

In der dritten Etage des Gebäudes ist heute die Gemäldesammlung untergebracht, die ihren Schwerpunkt auf Werke der italienischen Renaissance legt. Darüber hinaus umfasst die Sammlung Gemälde aus dem 13.-18. Jahrhundert und viele Werke flämischer, niederländischer, französischer und deutscher Künstler dieser Zeit. Eine umfangreiche Ausstellung von Selbstportraits aller Epochen bis in die Gegenwart ist im "Corridoio Vasariano" zu sehen. Dieser Teil des Gebäudes, ebenfalls von Vasari erbaut, verbindet die Uffizien auf der einen Seite mit dem Palazzo Vecchio und auf der anderen Seite über die Ponte Vecchio mit dem Palazzo Pitti.

Im Erdgeschoss verlaufen über die gesamte Länge der West-und Südseite Kolonnaden mit Säulen und Pfeilern im Wechselspiel. In die Pfeiler sind Nischen eingelassen, die jeweils mit einem Tonnengewölbe ausgestattet und reliefartigen Rahmen gestaltet sind.