Das Innere des Doms ist durch hohe rundbogige Arkaden dreischiffig unterteilt. Die Wände und Säulen sind mit weiß-dunkelgrünen Marmorquerstreifen verkleidet, und vom Deckengewölbe leuchten aufgemalte Sterne vom blauen Untergrund. Unter dem Gesims zwischen Wölbung und Bogen des Mittelschiffs reihen sich chronologisch Terrakottabüsten von päpstlichen Häuptern.

Berühmtestes Einzelstück des Doms ist die achteckige Kanzel Nicola Pisanos, die er zusammen mit seinem Sohn Giovanni, Arnolfo di Cambio und einigen weiteren Helfern von 1266-1268 schuf. Der Kanzelkörper ruht auf neun Säulen aus Granit, Porphyr und grünem Marmor, von denen vier auf Löwen stehen und die mittlere von den Personifikationen der sieben freien Künste -wie Astronomie oder Musik- und der Philosophie getragen wird. In den Relieffeldern der Kanzelwände sind Szenen aus dem Leben Christi und das Jüngste Gericht zu sehen. Im Vergleich zur älteren Kanzel des Baptisteriums von Pisa dominieren hier die lebendig herausgearbeiteten Figuren, die den Übergang zu gotisierenden Elementen erkennen lassen.

Aus der immensen Fülle der Ausstattung ist die Cappella Chigi im rechten Querschiff zu beachten, in der die meisten Ausstattungsstücke wie der Altar, die Skulpturen der Maria Magdalena und des Heiligen Hieronymus von Gian Lorenzo Bernini geschaffen wurde.

Am marmornen Hochaltar von Peruzzi -1532- bestechen das Bronzetabernakel Vecchiettas von 1467. Die acht ebenfalls aus Bronze gefertigten Engel an den Chorpfeilern stammen von Beccafumi -1550-, der auch die Apsis mit den Fresken ausstattete. Das runde Glasfenster der Chorwand, mit Darstellungen aus dem Marienleben, wurde 1288 nach einem Entwurf von Duccios begonnen und ist das älteste Glasfenster Italiens. Das Chorgestühl ist ebenfalls erwähnenswert, das mit Intarsienarbeiten von Fra Giovanni da Verona -1503- verziert ist. Die prunkvollen Mittelsitze im Stil der Renaissance wurden hingegen von Teseo Bartolini da Pienza und Benedetto di Giovanni da Montepulciano nach Zeichnungen von Riccio in der zweiten Hälfte des 16. Jahrhunderts geschnitzt.

In einer Eckkapelle befindet sich das Grabdenkmal des Kardinals Riccardo Petroni ein frühes Hauptwerk des Tino da Camaino. 1482 wurde die Cappella di San Giovanni Battista von Giovanni di Stefano im Frührenaissance-Stil für das Armreliquar Johannes des Täufers erbaut. Neben den Fresken Pinturicchios von 1505 sind hier auch ein achteckiges Taufbecken zu finden, das Antonio Federighi zugeschrieben wird, sowie eine Bronzestatue des Täufers, eines der letzten Arbeiten Donatellos aus dem Jahre 1457.

Neben der Libreria-Piccolimini verlangt noch der Piccolomini-Altar Aufmerksamkeit, der mit seinem dreistöckigem Renaissance-Aufbau auffällt. Er wurde von Andrea Bregno 1485 begonnen. Besonders sehenswert sind hier zudem die Heiligenstatuetten, die als Frühwerke Michelangelos gelten.

Rechts vom Piccolomini-Altar befindet sich die Libreria-Piccolimini -die Dombibliothek- in einem rechteckigen Raum.